肝细胞癌(HCC)是全球第六大常见癌症，也是全球肿瘤死亡的第四大原因，每年约有841 000例新发病例和782 000例死亡病例[1]。HBV和HCV慢性感染、嗜酒、黄曲霉毒素、与肥胖和糖尿病相关的代谢综合征是引起HCC的重要原因[2]。HCC患者诊断时，往往处于晚期或者无法治愈的阶段，因此深入研究HCC发病机制，发现具有早期诊断和评价预后的生物标志物，寻找潜在的治疗靶点是必要的[3]。
跨膜蛋白6超家族成员2(transmembrane 6 superfamily member 2，TM6SF2)位于19号染色体上，为7～10跨膜蛋白，亚细胞结构主要位于内质网和高尔基体，表达具有一定的组织特异性，主要分布于肾脏、脑组织、小肠及肝脏中[4]。其具体功能仍不清楚，有研究[5]表明TM6SF2参与肝细胞分泌极低密度脂蛋白的途径，以及甘油三酯富集至载脂蛋白B100的过程，影响调节脂质合成。在一项大型欧洲协作研究[6]中，评估了一个包含1201例非酒精性脂肪性肝炎(NASH)风险人群的大型横断面队列，证明TM6SF2 E167K突变与肝脏脂肪堆积相关的肝损伤疾病谱有关，包括NASH、肝细胞气球样变和坏死性炎症。这提示TM6SF2在肝病的发展中起着重要的作用，但其在HCC中的作用仍不清楚。
本研究使用数据库分析TM6SF2在HCC组织中的表达情况，探讨TM6SF2与HCC患者生存时间的相关性，分析在HCC组织中与TM6SF2相互作用的表达相关基因并且预测其潜在的生物学功能。
1 材料与方法
1.1 提取TM6SF2表达量数据 TCGA数据库和Genotype-Tissue expression(GTEx)数据库收录了不同组织中基因的mRNA表达量数据。Gene expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)( 表达水平与HCC患者的生存分析。
1.2 预测TM6SF2表达相关基因 利用cBioPortal( Hepatocellular Carcinoma(LIHC)(TCGA，Provisional)，获取TM6SF2表达相关基因，筛选条件以Spearman相关系数>|0.6|为标准。用在线分析工具( 其中具有RNA-seq测序数据的非复发性实体瘤样本为369例,其中包括了3例纤维板层肝细胞癌以及7例肝细胞-胆管上皮细胞混合癌,余为HCC。纤维板层肝细胞癌和肝细胞-胆管上皮细胞混合癌所占比例约2.7%, 为HCC的特殊类型。
1.3 预测TM6SF2生物学功能 利用DAVID6.8( Interaction，PPI)网络，选择“Multiple proteins”输入表达相关基因以及TM6SF2，物种选择“Homo sapiens”，且代表蛋白之间相互作用强度的置信度选择“medium confidence(0.400)”[13]。同时利用Cytoscape[7]软件对PPI进行可视化，并且选用MCC法，选取前10个做为关键的表达相关基因。
1.4 统计学方法 采用SPSS21.0 进行数据分析。用t检验验证HCC与癌旁组织基因mRNA表达差异。用Spearman相关系数分析基因表达的相关性。采用Kaplan-Meier生存分析计算生存率，采用广义log-rank检验估计生存率的差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 人体各肿瘤组织中TM6SF2基因的差异性表达结果 通过GEPIA数据库分析提示，TM6SF2基因在胆管癌、肝细胞癌等癌组织表达降低，而在胰腺癌、嗜铬细胞癌等癌组织表达升高(图1a)。TM6SF2基因在HCC中的表达水平低于正常组织(|log2FC|cut-off=0.5，P<0.01)(图1b)。
2.2 TM6SF2表达水平与HCC患者预后的关系 以表达量前25%作为高表达组(n=90)，后25%作为低表达组(n=90)，通过OncoLnc数据库分析，相对于高表达的患者，TM6SF2低表达可降低HCC患者总体生存时间(χ2=9.897，P<0.01)(图2)。
2.3 TM6SF2表达相关基因生物信息学分析 利用cBioPortal和linkedOmics分析TCGA中HCC数据，获取49个与TM6SF2表达相关的基因(图3)。通过DAVID6.8数据库进行GO分析，发现TM6SF2表达相关基因主要富集在脂肪酸连接酶激活、脂肪酸合成、凝血酶调节等过程(P<0.05)(图4a)；KEGG通路分析，发现TM6SF2表达相关基因主要富集在丙氨酸代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors，PPAR)信号通路、胆汁分泌等过程(P<0.05)(图4b)。通过STRING分析，TM6SF2在细胞信号转导通路中处于重要位置，PPI富集：P<0.05，节点数为48。通过Cyto-scape软件对PPI数据进行可视化处理， 并采用MCC法筛选潜在的关键基因，发现SERPINC1(serpin family C member 1)、NR1I2(nuclear receptor subfamily 1 group I member 2)、SERPINA10(serpin family A member 10)、SLC10A1(solute carrier family 10 member 1)、C8A(complement C8 alpha chain )、PLG(plasminogen) 等在TM6SF2表达相关基因中起重要作用(图5)。
图2TM6SF2与HCC患者的生存曲线分析
图3TM6SF3表达相关基因
3 讨论
家族研究以及孪生子研究[14-15]提示基因多态性影响非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)易感性以及疾病进程，而目前通过全基因组关联分析研究发现了多种重要的突变基因位点，其中PNPLA3、GCKR、MBOAT7、TM6SF2这4个基因位点的单核苷酸突变与NAFLD的研究引人注目。Patatin样磷脂酶域蛋白3(patatin-like phospholipase domain containing 3，PNPLA 3)位于22号染色体上的非Ca2+依赖的Patatin样磷脂酶家族成员，所编码的蛋白为由481个氨基酸组成的非分泌蛋白——Adiponutrin，为四次跨膜蛋白，主要存在于细胞膜和细胞质内脂滴上[16]。PNPLA3 I148M (rs，C>G)是与NAFLD发生发展高度相关的遗传变异, 有研究[17]表明欧洲人群中GG纯合子变异体使与NAFLD相关的HCC风险增加了10倍。有趣的是，PNPLA3 I148M携带者肝硬化和HCC的风险明显增加, 独立于脂肪变性的倾向。这表明PNPLA3直接参与纤维化形成和癌变的过程。
目前研究[4]表明，TM6SF2主要在肝脏、肾脏和肠道组织中表达，通过调节甘油三酯分泌和增加细胞内脂滴浓度，影响肝脏脂质代谢。编码TM6SF2 E167K (rs，C>T)的基因突变导致TM6SF2蛋白质结构不稳定，易被降解，进而导致TM6SF2蛋白表达水平下降，是一种功能丧失型基因突变，TM6SF2 E167K与肝内甘油三酯水平升高和极低密度脂蛋白分泌降低相关[5]。有趣的是，携带这种变异的个体患NAFLD的风险更高，但心血管疾病的风险较低，这可能与TM6SF2 E167K影响极低密度脂蛋白分泌，促进脂质在肝组织中堆积，而降低循环中脂质含量有关。与PNPLA3 I148M 类似，TM6SF2 E167K 不仅可导致NAFLD的进展，还可导致酒精性肝病的进展，从脂肪变性发展为纤维化和肝硬化[18]。目前TM6SF2在HCC中的研究较少。Falleti等[19]调查发现，TM6SF2 E167K突变是HCC的危险因素，但这种关联在酒精性肝病中明显，而在病毒性肝病中无明显差异。Raksayot 等[20]通过在泰国人群中的调查，同样发现TM6SF2 E167K多态性与非HBV或HCV感染所致HCC独立相关，而与HBV或HCV感染所致HCC无相关性。最近中国的前瞻性研究[21]发现，PNPLA3和TM6SF2基因多态性与酒精性患者的HCC独立相关，且呈剂量依赖性，但与其他病因无关。TM6SF2 CT杂合子或TT纯合子可能是酒精相关性肝硬化中发生HCC的潜在遗传危险因素。综上提示TM6SF2可能在HCC的发病及进展中起着重要作用。
生物信息学在医学科研中已成为不可或缺的一项利器，可以整合和充分利用目前浩瀚的数据资源。本研究应用多种在线工具，对TCGA数据库进行数据挖掘和分析。首先，利用GEPIA 数据库研究TM6SF2转录水平上在HCC的表达情况。 结果显示，HCC组织中TM6SF2 mRNA表达水平均显著低于正常对照组织(P<0.01)，且生存分析表明TM6SF2基因在HCC中低表达患者与高表达患者相比，总生存率降低(P<0.01)，提示TM6SF2是HCC潜在的抑癌基因。接下来，综合利用cBioPortal和linkedOmics，筛选出49个与TM6SF2在HCC中表达相关的基因。GO分析显示TM6SF2基因参与调节许多生理过程，但主要集中在物质代谢过程，其中与脂质代谢有着密切的联系，这提示TM6SF2低表达所致的肝组织中脂质堆积以及脂毒性，可能是HCC发病机制中不可忽视的环节。利用STRING数据库进行PPI网络分析，结题提示SERPINC1、NR1I2、SERPINA10、SLC10A1、C8A、PLG基因可能与 TM6SF2有密切关系。
有趣的是，通过KEGG通路分析，发现TM6SF2参与了PPAR信号通路环节。PPAR参与了全身和肝脏的脂质代谢过程，机制与调节线粒体和过氧化物酶体对脂肪酸的β氧化速率、脂质代谢的从头合成、肝脏从外周组织摄取脂肪酸的能力、脂蛋白载运能力等有关[22]。同时PPAR在肿瘤的发生发展中起重要作用，与其参与细胞周期、抗炎反应和凋亡有关[23]。这为后续TM6SF2在脂质代谢和肿瘤中作用的机制研究提供了依据。
本研究存在以下几点不足：(1)HCC的致病因素包括了慢性病毒性肝炎(如乙型肝炎和丙型肝炎)、毒素(如酒精性肝病和血色素沉着症)、代谢性疾病(NASH、2型糖尿病)、先天性疾病(如α1-抗胰蛋白酶缺乏症)等，本研究采用TCGA数据库做整体分析，未能进行致病因素的亚组分析。(2) NAFLD作为一种与机体代谢紊乱相关的疾病, 可发展为NASH、隐源性肝硬化，甚至有可能发展为HCC，而NASH是NAFLD进展中的关键环节，在NASH相关的肝硬化患者中，HCC的发病率每年至少有1%～2%[24-25]。而TM6SF2主要在脂质代谢中发挥作用且与NASH明显相关，可参与NASH相关性HCC发生，收集NASH相关性HCC数据或能对TM6SF2以及NASH在肝细胞发生机制中的作用提供有意义的参考，本研究查看TCGA中HCC患者的临床数据，NAFLD/NASH相关的患者仅12例，样本量较小，同时查询了Gene expression Omnibus GEO数据库，未能找到合适的人NAFLD/NASH相关的HCC芯片数据，故本研究未单独做TM6SF2在NAFLD/NASH相关HCC中表达情况和功能的分析。(3)本研究得到的生物功能分析结果，需要后续实验的验证。(4)本研究通过在线工具简洁分析TM6SF2与HCC的关系,并未单独将少量存在的特殊类型的HCC剔除, 后续研究会构建严谨的实验体系验证本文分析的结果。
综上所述，应用数据库可进行大样本分析，科学地证明了TM6SF2在HCC组织中呈低表达状态，且影响患者预后，而利用TRING数据库分析获得了与TM6SF2相关的作用靶基因，为进一步研究TM6SF2在HCC发生发展中的作用提供了线索和依据。
[1]BRAY F, FERLAY J, SOERJOMATARAM I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6): 394-424.
[2]LLOVET JM, ZUCMAN-ROSSI J, PIKARSKY E. Hepatocellular carcinoma[J]. Nat Rev Dis Primers, 2016, 2: .
[3]LLOVET JM, MonTAL R, SIA D, et al. Molecular therapies and precision medicine for hepatocellular carcinoma[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2018, 15(10): 599-616.
[4]MAHDESSIAN H, TAXIARCHIS A, POPOV S, et al. TM6SF2 is a regulator of liver fat metabolism influencing triglyceride secretion and hepatic lipid droplet content[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(24): 8913-8918.
[5]KOZLITINA J, SMAGRIS E, STENDER S, et al. Exome-wide association study identifies a TM6SF2 variant that confers susceptibility to nonalcoholic fatty liver disease[J]. Nat Genet, 2014, 46(4): 352-356.
[6]CHALASANI N, WILSON L, KLEINER DE, et al. Relationship of steatosis grade and zonal location to histological features of steatohepatitis in adult patients with non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Hepatol, 2008, 48(5): 829-834.
[7]KE RS, ZHANG K, LV LZ, Et al. Prognostic value and oncogene function of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 overexpression in HBV-related hepatocellular carcinoma[J]. oncol Lett, 2018, 16(3): 3746-3756.
[8]ANAYA J. OncoLnc: linking TCGA survival data to mRNAs, miRNAs, and lncRNAs[J]. PeerJ Computer Science, 2016, 2: e67.
[9]GAO J, AKSOY BA, DOGRUSOZ U, et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal[J]. Sci Signal, 2013, 6(269): pl1.
[10]VASAIKAR SV, STRAUB P, WANG J, et al. linkedOmics: Analyzing multi-omics data within and across 32 cancer types[J]. Nucleic Acids Res, 2017, 46(D1): d956-d963.
[11]HUANG DW, SHERMAN BT, LEMPICKI RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J]. Nat Protoc, 2009, 4(1): 44-57 .
[12]SZKLARCZYK D, FRANCESCHINI A, WYDER S, et al. STRING v10: Protein-protein interaction networks, integrated over the tree of life[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 43(D1): d447-d452.
[13]ZHANG YP, WANG F, CHEN PF, et al. expression and significance of the ABAT gene in hepatocellular carcinoma: An analysis based on data mining[J]. J Clin Hepatol, 2019, 35(3): 553-558. (in Chinese)
张玉鹏, 王帆, 陈鹏飞, 等. 基于数据挖掘分析ABAT基因在肝细胞癌中的表达及意义[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(3): 553-558.
[14]ESLAM M, GEORGE J. Genetic and epigenetic mechanisms of NASH[J]. Hepatol Int, 2016, 10(3): 394-406.
[15]ESLAM M, VALENTI L, ROMEO S. Genetics and epigenetics of NAFLD and NASH: Clinical impact[J]. J Hepatol, 2018, 68(2): 268-279.
[16]ROMEO S, KOZLITINA J, XING C, et al. Genetic variation in PNPLA3 confers susceptibility to nonalcoholic fatty liver disease[J]. Nat Genet, 2008, 40(12): 1461-1465.
[17]DonGIOVANNI P, ROMEO S, VALENTI L. Genetic factors in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver and steatohepatitis[J]. Biomed Res Int, 2015, 2015: .
[18]ANSTEE QM, SETH D, DAY CP. Genetic factors that affect risk of alcoholic and nonalcoholic fatty liver disease[J]. Gastroenterology, 2016, 150(8): 1728-1744. e7.
[19]FALLETI E, CUSSIGH A, CMET S, et al. PNPLA3 rs and TM6SF2 rs variants increase the risk of hepatocellular carcinoma in alcoholic cirrhosis[J]. Dig Liver Dis, 2016, 48(1): 69-75.
[20]RAKSAYOT M, CHUAYPEN N, KHLAIPHUENGSIN A, et al. Independent and additive effects of PNPLA3 and TM6SF2 polymorphisms on the development of non-B, non-C hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol, 2019, 54(5): 427-436.
[21]YANG J, TREPO E, NAHON P, et al. PNPLA3 and TM6SF2 variants as risk factors of hepatocellular carcinoma across various etiologies and severity of underlying liver diseases[J]. Int J Cancer, 2019, 144(3): 533-544.
[22]MELLO T, MATEROZZI M, GALLI A. PPARs and mitochondrial metabolism: From NAFLD to HCC[J]. PPAR Res, 2016, 2016: .
[23]KIMURA O, KonDO Y, SHIMOSEGAWA T. PPAR could contribute to the pathogenesis of hepatocellular carcinoma[J]. PPAR Res, 2012, 2012: .
[24]DAI HH, MEI LQ. Advances in nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma research[J]. J Clin Hepatol, 2012, 28(10): 797-800. (in Chinese)
代鸿华, 梅礼强. 非酒精性脂肪性肝病与肝细胞癌关系的研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2012, 28(10): 797-800.
[25]DIEHL AM, DAY C. Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis[J]. N Engl J Med, 2017, 377(21): 2063-2072.
文章来源：电子与信息学报 网址: http://dzyxxxb.400nongye.com/lunwen/itemid-61303.shtml
上一篇： 微课在高中信息学奥赛辅导中的实践探究
下一篇： 地质学论文_陆相细粒沉积岩与古土壤深时气候分析方法综述
